Разработка метода стабильной поляризации макрофагов моноцитарного происхождения и исследование их активности в клеточной модели рака яичника

Проект направлен на получение макрофагов со стабильным провоспалительным фенотипом М1 и исследование их противоопухолевых свойств на in vitro моделях рака яичника. Рак яичников занимает третье место в структуре онкогинекологической заболеваемости в России, уступая по частоте встречаемости раку эндометрия и раку шейки матки. 

Для решения проблемы стабильной поляризации макрофагов в сторону М1 фенотипа важным этапом проекта станет генетическая модификация макрофагов, полученных из CD14+ и/или CD16+ моноцитов, представляющих две основные моноцитарные субпопуляции в крови. Будет проведен биоинформатический анализ с целью выявления наиболее значимых различий во внутриклеточном сигналинге при М1 поляризации макрофагов. Впервые будет охарактеризована способность СD14+ и CD16+ субпопуляций моноцитов к М1-поляризации, проведена оценка про- и противовоспалительной функции, фагоцитарной активности, анализ секретома, экспрессии про- и противовоспалительных генов.

Впервые будет получена стабильная культура М1 поляризованных макрофагов путем трансфекции или трансдукции клеток векторами, кодирующими компоненты для редактирования генома, на основании данных биоинформатического анализа.

Задачи проекта

1. Оценка потенциала классической (CD14++CD16-) и неклассической популяций (CD14+CD16++) моноцитов, макрофагальных предшественников, к поляризации в М1 макрофаги под воздействием коктейля цитокинов, факторов роста, LPS. Определение популяции моноцитов с максимальными иммунофенотипическими и функциональными показателями М1 поляризации для последующего анализа транскриптома.
2. Биоинформатический анализ транскриптома клеток in silico для выбора группы генов-мишеней, необходимых для поддержания стабильной поляризации моноцитов в сторону М1 фенотипа.
3. Генетическая модификация клеток: повышение экспрессии генов, вовлеченных в М1 поляризацию или ингибирование поляризации в сторону М2 фенотипа. В рамках решения этой задачи для выбранной субпопуляции моноцитов предлагается использование трансфекции вектором, лентивирусной трансдукции, сайленсинга, а также проведение нокаута с использованием вектора, кодирующего CRISPR/Cas9 с гидовой РНК, комплементарной гену-мишени. В связи со сложностью доставки конструкта в клетки первичной культуры наиболее оптимальный способ будет выбран в ходе эксперимента. 
4. Оценка стабильности М1 поляризованных макрофагов, их фагоцитарных свойств, секретома.
5. Исследование противоопухолевой активности полученных М1 макрофагов in vitro при сокультивировании с линейными клетками опухоли.